Ojos para lo infinitesimal III: gotas de sabiduría

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Recuerdo que la primera vez que vi usar aceite en un microscopio simple durante una práctica en el bachillerato, no podía entender el sentido de tratar un objetivo como si fuese un tomate en ensalada. Pero todo tenía su explicación…

TEXTO POR DANIEL MORENO
ILUSTRADO POR MARIONA RODRÍGUEZ
ARTÍCULOS
MICROSCOPIA
31 de Agosto de 2015

…y para ser exactos, la cantidad de aceite usada era mínima, tan solo una gotita de un aceite de enebro sin utilidad culinaria, colocada entre la punta del objetivo y la lámina de cristal que cubría la muestra. Este es de esos artificios usados en microscopía que siempre han llamado mi atención. Sí, incluso en técnicas de microscopía óptica avanzadas, la mejor resolución se sigue obteniendo usando objetivos de inmersión, en aceite, glicerinas o en agua. Podría decirse que esa gota actuaba como una gafa para el objetivo. ¿Cómo podía ser que un sistema óptico tan complejo necesitase una gota de líquido para poder ver bien? Me parecía una guasa, pero no lo era, existía una muy buena razón para ello, que tiene el pintoresco nombre de apertura numérica (abreviado en inglés: NA). Este parámetro depende del índice de refracción del medio entre la muestra y el objetivo. Es decir, de la relación numérica entre los ángulos de incidencia y refracción de un haz de luz que lo atraviesa. También depende de la distancia focal mínima a la que puede operar el objetivo, que es estimada como el ángulo máximo que un rayo de luz procedente de la muestra puede tener para entrar en el objetivo.   

Simplificando un poco estos conceptos, se podría decir que, en general, la NA determina la resolución de un objetivo. Un objetivo con elevada NA tiene más resolución que otro con menos, y aunque a primera vista pudiera pensarse que un objetivo con más aumentos debe tener más NA, no siempre es el caso, de hecho, los aumentos (magnificación) del objetivo no intervienen en las ecuaciones que determina la resolución. Básicamente, un objetivo con elevada apertura numérica es capaz de captar más luz procedente de la muestra, al margen de cuál sea su aumento. 

Ernst Abbe ya lo determinó en el siglo XIX: cuanta más luz procedente de la muestra se captara por el objetivo, más precisa sería la imagen observada. Sin embargo, la luz que sale de la muestra se dispersa debido a la difracción. Dado el tipo de lente y la separación de aire entre ambos, muchos de los haces luminosos procedentes de la muestra nunca entran en el objetivo. El uso de aceite con un índice de refracción alto, similar al de la lente, hace que la difracción sea menor, compactando los haces de luz y permitiendo que una mayor cantidad de luz entre en el objetivo. Por ello, los objetivos que no usan aceite son más cómodos de operar, pero tienen aperturas numéricas más bajas y resoluciones menores que los «pringosos» objetivos de inmersión. 

Esquema de la dispersión de la luz procedente de la muestra en un objetivo sin y con aceite
Esquema de la dispersión de la luz procedente de la muestra en un objetivo sin y con aceite. Fuente: Daniel Moreno.

Así pues, unas simples gotas de aceite, glicerina o agua en la punta de un objetivo parecen un precio razonable a pagar por un aumento significativo en la resolución. Sin embargo, los objetivos de inmersión tienen poca profundidad de campo, es decir, la franja nítida por delante y por detrás del punto enfocado es muy estrecha. Además, tienen una distancia de trabajo (distancia del objetivo a la muestra) muy corta, de manera que solo funcionan con muestras extraordinariamente finas, con un grosor del orden de decenas de micrómetros. Por ello es importante sopesar cual es la resolución que se necesita. 

Imagen de un campo con cuatro células tomada en un microscopio de fluorescencia con un objetivo de inmersión. La imagen de la izquierda esta tomada sin aceite y la de la derecha con aceite. Las células son verdes porque les hacemos sintetizar una proteína verde fluorescente llamada GFP, de otro modo serían transparentes y sería mucho mas difícil verlas.
Imagen de un campo con cuatro células tomada en un microscopio de fluorescencia con un objetivo de inmersión. La imagen de la izquierda esta tomada sin aceite y la de la derecha con aceite. Las células son verdes porque les hacemos sintetizar una proteína verde fluorescente llamada GFP, de otro modo serían transparentes y sería mucho mas difícil verlas. Fuente: Daniel Moreno.

 

En óptica, la resolución se entiende como la distancia mínima a la que deben encontrarse dos objetos para que puedan verse como objetos separados. El límite de resolución teórica fue propuesto por Ernst Abbe en microscopía y por John Rayleigh en astronomía. Ambos criterios son prácticamente similares (aunque casi siempre se usa el de Rayleigh) y muestran que la resolución depende de la longitud de la onda de la luz usada para observar y de la apertura numérica del sistema óptico. El límite de resolución de la microscopia óptica convencional ronda los 0,2 micrómetros. Es decir, usando el mejor microscopio óptico con el objetivo con mayor apertura numérica posible y su correspondiente gotita de aceite, seremos capaces de ver como independientes dos objetos microscópicos que se encuentran separados por una distancia poco mayor que un virus del resfriado. 

Ese límite teórico de entre 200 a 222 nanómetros, conocido como límite de difracción, ha dado mucho de sí. Todavía hoy, la mayoría de los que usamos a diario microscopios, solo necesitamos alcanzarlo en contadas ocasiones. Normalmente, un rápido vistazo con un objetivo de aire será suficiente para saber de qué humor están hoy las células con las que trabajas o cómo les ha sentado lo que les has hecho en tu último experimento. No en vano, muchas de las macroestructuras que alberga una célula se descubrieron bastante antes de que la tecnología pudiese alcanzar o  incluso rebasar el límite de difracción. Mucho antes de tener la fuerza para ir más allá ese límite, hubo que usar mucha maña para lidiar con la común y uniforme transparencia de la vida a nivel microscópico. Pero eso son historias que serán contadas en otra ocasión. 

Referencias: 

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