Arthur C. Clarke dejó escrito que la única posibilidad de descubrir los límites de lo posible es aventurarse un poco más allá de ellos, hacia lo imposible. Uno de esos límites en microscopía óptica ha sido la barrera que impone la física del universo en que vivimos: el límite de difracción de la luz. La difracción de la luz evita que podamos distinguir como independientes dos estructuras que están separadas menos de 200 nanómetros, escondiendo a nuestros ojos muchos de los eventos que rigen la vida de nuestras células y la nuestra propia; los cuales ocurren allá abajo, a escalas infinitesimales. Descubramos hoy cómo se encontró ese límite y unas pinceladas de la primera osadía que nos llevaría a rebasarlo.
Como dijo aquel, toda aventura empieza con un pequeño paso. Este ocurrió hacia 1835, cuando Gregory Airy describió un curioso fenómeno: un haz de luz que sale de una lente o abertura circular forma patrones diferentes al del haz de luz inicial. A estos patrones se les denominaría discos de Airy y se generan porque la luz difracta, es decir, cambia de dirección cuando se encuentra con un objeto (no confundir con refracción, tal y como ya explicamos en Ojos para lo infinitesimal: la doma de la luz.
Disco de Airy.Fuente: Wikipedia Commons
La difracción es un fenómeno que les ocurre a todas las ondas al pasar por una ranura de diámetro menor o igual que su longitud de onda y chocar contra los bordes. También les ocurre a los haces de luz al pasar por una lente y chocar con su estructura molecular. Dicho fenómeno ya llevaba fascinando a los sabios algún que otro milenio hasta que Thomas Young nada más empezar el siglo XIX fue capaz de explicar el fenómeno. Deduciendo además que la luz era una onda, dado que difractaba igual que las ondas de un fluido.
La difracción es un fenómeno que les ocurre a todas las ondas al pasar por una ranura de diámetro menor o igual que su longitud de onda y chocar contra los bordes.
Difracción de ondas al pasar por una abertura. Esquema animado similar a uno de los experimentos de Thomas Young.Fuente: Wikipedia Commons
Poco después, en 1873 Ernst Abbe estableció formalmente las ecuaciones que definen el límite físico de la resolución óptica, aunque habían sido vislumbradas poco antes por Emile Verdet. Abbe determinaría que debido al fenómeno de difracción de la luz, la distancia mínima a la que dos puntos cercanos son distinguibles como independientes es tan grande como la mitad de la longitud de onda de la luz utilizada para observar la muestra. Dado que el espectro de luz visible tiene un rango de longitud de entre aproximadamente 380 y 780 nanómetros, la máxima resolución teórica que se podría alcanzar usando microscopía óptica sería de alrededor de algo menos de 200 nanómetros. Es decir, dos objetos que se encuentran a 200 nanómetros o menos desviaran la luz de manera que parecerán uno solo.
Diagrama de resolución dos puntos. a) Dos puntos bien resueltos. b) Dos puntos en el límite de resolución. c) Dos puntos no resueltos. d) Cuando los dos objetos están separados por una distancia mayor al radio del disco de Airy se verán como objetos distintos, mientras que dos objetos separados por una distancia igual o menor al radio del disco de Airy se mezclarán y aparecerán como un solo objeto. Fuente.
Casi inmediatamente después del trabajo de Abbe, August Köhler y Moritz von Rohr intentaron romper ese límite usando luces con longitud de onda más corta, como la de la luz ultravioleta (de menos de 380nm), como también explicábamos en la entrada anterior de esta serie dedicada a lo infinitesimal: la vida en llamas. Sin embargo, no tuvieron mucho éxito dado que la luz ultravioleta es muy difícil de observar para nuestros ojos.
De hecho, hasta casi acabado el siglo veinte el límite permaneció infranqueable. Aunque en algún punto se dieron cuenta de que para incrementar la resolución, lo que sobraba era la luz procedente de todo aquello que no se quería observar en la muestra. Uno de los primeros en darse cuenta fue el genial Marvin Minsky, que allá por 1957 se sacó de la manga el gallardo microscopio confocal. Una pieza clave en las ciencias de la vida de la última media centuria, detrás de cuya complejidad técnica se esconde una idea relativamente simple. Una abertura similar a un diafragma —llamada pinhole— colocada delante del objetivo y de la fuente de luz que ilumina la muestra evita que nos llegue luz de fuera del plano focal, que será tanto más fino cuanto más cerrada esté la abertura. Cuanto más fina es la capa de luz que atraviesa la muestra más resolución rendirá, ya que será capaz de distinguir estructuras cada vez más pequeñas.
El genial Marvin Minsky allá por 1957 se sacó de la manga el gallardo microscopio confocal. Una pieza clave en las ciencias de la vida de la última media centuria.
Esquema comparativo simplificado de un microscopio confocal y un microscopio de fluorescencia normal.Fuente: Daniel Moreno
Pronto, la poderosa unión del microscopio confocal con los marcadores fluorescentes empezó a acercarse peligrosamente al límite aunque sin llegar a tocarlo. El punto focal todavía era demasiado grande comparado con el límite de resolución. Además, el uso de marcadores fluorescentes era indispensable ante la transparencia de la vida pero no estaban exentos del fenómeno de difracción y de otros problemillas. Simplificando bastante, se podría decir que la longitud de onda de la luz es reflejo de la energía que contienen los fotones, que son las partículas que componen esa luz. Cuanto más corta es la longitud de onda, más energéticos son los fotones del haz de luz. Para activar un marcador fluorescente es necesario que sea golpeado por un fotón de una determinada energía. Para hacer brillar los marcadores fluorescentes más comunes, como la GFP, la energía del haz de luz necesaria es relativamente elevada y esto tiene efectos colaterales perniciosos para la resolución. Entre ellos, la activación masiva de todos los marcadores fluorescentes de la zona iluminada y la excitación inespecífica de otras moléculas del medio circundante al marcador fluorescente, lo cual que genera mucha luz de fondo.
Así sería hasta que a principios de la última década del siglo pasado la barrera empezó a temblar de verdad al alcanzarse con solvencia el límite teórico de la resolución óptica. Por un lado, Frederick Lanni y Lansing Taylor consiguieron hacer todavía más finas las láminas de luz que atraviesan la muestra usando dos haces láser modulados de manera que al cruzarse sobre la muestra generan una rejilla de capas de luz superfinas.
Por el otro, Stefan Hell y Ernst Stelzer inventaron el 4Pi microscope, una especie de microscopio confocal modificado que usa dos objetivos opuestos para observar la muestra en el mismo punto por ambos lados, lo que rinde un punto focal más pequeño que usando un objetivo solo. Es decir, iluminando una zona mucho mas pequeña y definida. Además, lo acoplaron a otra técnica microscópica denominada microscopía de excitación por dos fotones surgida un par de años antes. Dicha técnica había nacido, en realidad, con la idea de poder estudiar muestras más gruesas, como tejidos vivos, sin tener como objetivo aumentar la resolución.
A principios de la última década del siglo pasado la barrera empezó a temblar de verdad al alcanzarse con solvencia el límite teórico de la resolución óptica.
La microscopía de excitación por dos fotones había sido desarrollada en 1990 por Windfried Denk y Watt Webb. Usa pulsos láser muy cortos y compuestos de fotones de longitudes de onda mucho más largas y por tanto menos energéticas que interaccionan menos con la muestra, con lo que penetran más. Además, al ser menos energéticos, un solo fotón es insuficiente para activar a un molécula de marcador fluorescente como por ejemplo la GFP. Por el mismo motivo, la excitación inespecífica de otras moléculas de la muestra es mucho menor generando menos luz de fondo. De hecho, el truco está en que dos fotones deben golpear a la vez al mismo marcador fluorescente para poder hacerlo brillar. Esto es un evento muy raro a nivel molecular, cuya existencia ya calculó María Goeppert-Mayer en 1931. Aprovechándonos de la rareza de este fenómeno, solo unas pocas moléculas de marcador fluorescente se iluminan entre millones, evitando que el exceso de luz emitida disminuya la resolución. Algo así como si en una vista aérea nocturna de vuestra ciudad quisieseis distinguir dónde está vuestra casa entre el tumulto de luces; sería más fácil si hubiese un apagón y nuestra madre os hiciese señas con una linterna.
Más de cien años de tesón científico y audacia tecnológica habían hecho falta, pero a las puertas del siglo XXI una barrera, que a priori parecía inexpugnable, estaba apunto de caer. El entendimiento de los fenómenos que rigen la luz y su interacción con la materia habían sido la clave para domar a la luz más allá de lo que parecía físicamente posible. Y con la forja de cada ingenioso microscopio se observaban nuevas maravillas microscópicas jamás pensadas antes. No obstante, aún quedaba lo mejor, porque en los albores del nuevo milenio nuestros ojos verían por fin más allá del límite.
Referencias
— Invention of the microscope. Nature milestones — 4Pi Microscopy — Benjamin Judkewitz and Changhuei Yang. 2014. Axial standing-wave illumination frequencydomainimaging (SWIF). OPTICS EXPRESS. — Stefan Hell and Ernst H.K. Stelzer.1992. Fundamental improvement of resolution with a 4Pi-confocal fluorescence microscope using two-photon excitation. Optics Communications. — Bailey et al. 1993. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature.
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