En la anterior entrega de esta serie os hablábamos de que la vida a nivel microscópico es prácticamente transparente y también de algunas tretas usadas para colorearla con el fin de hacerla visible. Hoy os traemos lo que yo consideraría la luz de Eärendil de la microscopía. Y fue Aequorea victoria, una medusa, no una Elfa, la que nos brindó la más brillante luz de entre los poderosos fuegos que nos permitirían ver estructuras microscópicas de la vida como si de estrellas se tratase.
Aunque la historia había empezado mucho antes, trasladémonos a 1962. Aquel año, el equipo de Osamu Shimomura, que estudiaba la bioluminiscencia de la mencionada medusa, fue capaz de aislar de ella una proteína luminiscente denominada aequorina. Junto con esta proteína, por casualidad, coaislaron otra de gran importancia. Una década después se confirmaba que esta otra proteína podía emitir luz fluorescente de color verde (de ahí que se le llame GFP por sus siglas del inglés: Green Fluorescent Protein). Sin embargo, tuvieron que pasar dos décadas hasta que el equipo de Douglas Phraser clonara el gen original de la GFP.
Figura de Aequorea victoria y de la estructura de la GFP.Fuente: Wikimedia Commons.
Con el gen clonado, el equipo de Martin Chalfie consiguió demostrar que la GFP podía expresarse en otros organismos como bacterias o gusanos donde seguía siendo fluorescente después de que estos organismos eran expuestos a una luz con cierta longitud de onda. Además, Chalfie fusionó la secuencia de la GFP a la de otras proteínas propias de esos organismos. Así pudo determinar, mediante la fluorescencia de la GFP, dónde se localizan esas otras proteínas dentro de los organismos. Casi al mismo tiempo, el laboratorio de Roger Tsien se las arregló para mejorar la secuencia natural de la GFP, haciéndola más estable y más brillante. Adicionalmente, en un alarde de bioingeniería, consiguieron cambiar la longitud de onda de la luz que la estimula para que coincidiese con las lámparas presentes en la mayoría de microscopios de fluorescencia.
Por aquel entonces, cuando la GFP vino al mundo, el microscopio de fluorescencia era un aparato cuya utilidad no era ni la sombra de lo que es hoy. Se lo habían sacado de la manga August Köhler y Moritz von Rohr en 1904 con la ecuación de Ernst Abbe para la resolución en la cabeza (leer Ojos para lo infinitesimal III). Si la resolución de un microscopio de luz visible era inversamente proporcional a la longitud de onda de la luz utilizada para iluminar la muestra, cuanto más corta fuese la longitud de onda de la luz más resolución tendría el microscopio. ¿Y qué luz podría usarse con longitud de onda más corta? Pues la archiconocida luz ultravioleta (UV).
Figura espectro de luz visible.Fuente: Wikipedia Commons.
El caso es que aunque Köhler y Rohr consiguieron aumentar al doble la resolución al observar algunos objetos con luz UV, su prototipo estaba bastante limitado dadas las dificultades técnicas del manejo de este tipo de luz. Además, el ojo humano es incapaz de ver directamente la luz UV. Sin embargo, casi accidentalmente se percataron de que alguno de esos objetos emitían luz en longitudes de onda más largas al ser irradiados con luz UV. Es decir, tenían fluorescencia directa (autofluorescencia). La fluorescencia se basa en un proceso de transferencia de energía. Una luz de longitud de onda corta (más energética) transfiere energía a una molécula susceptible de absorberla; después, esta molécula la emite en forma de luz con longitud de onda más larga y menos energética, dado que en la transferencia se pierde energía. Este fenómeno no estaba presente en todos los especímenes puestos bajo el objetivo porque no todas las moléculas pueden absorber energía de esta manera. Ello dificultó el uso de este tipo de microscopía al principio.
Figura esquema microscopio de epi-fluorescencia con espejo dicroico; el filtro dicroico garantiza que solo la luz emitida por la muestra llegue al ocular, sin que sea contaminada por la luz usada para iluminar.Fuente: Daniel Moreno Andrés.
Aun así, hacia 1930, varias mejoras técnicas llevarían a Phillip Ellinger y August Hirt a diseñar el prototipo de microscopio de epifluorescencia. En él, a diferencia de los anteriores, la luz que ilumina la muestra y la luz que esta emite pasan por el mismo objetivo, pero no se mezclan gracias a una compleja y problemática red de filtros. Estos aparatos harían uso de las recién desarrolladas técnicas de fluorescencia secundaria. Al principio, estas técnicas no eran otra cosa que la aplicación de productos químicos fluorescentes (llamados fluoróforos) a las muestras para resaltar sus estructuras. Pero hacia los años cuarenta Albert Hewett Coons tendría la genial idea de acoplar algunos de estos productos químicos fluorescentes a anticuerpos capaces de unirse específicamente determinadas proteínas. Nacía así la inmunofluorescencia, capaz de iluminar las estructuras formadas por las proteínas en las células. Poco después, en 1960, fueron apareciendo los primeros filtros dicroicos, que son unos espejos que permiten el paso de ciertas longitudes de onda mientras que reflejan otras. Ello simplificó el sistema y el manejo de los microscopios de epifluorescencia, lo cual se unió a las cada vez más depuradas técnicas de inmunofluorescencia, extendiendo el uso de la fluorescencia en el estudio del micromundo.
Figura Inmunofluorescencia. En el panel superior un esquema simple de cómo funciona la técnica de inmunofluorescencia. En el panel inferior ejemplo de células en diferentes estados de ciclo celular (de izd. a dcha. Metafase, anafase temprana, anafase tardía, telofase e interfase). En azul, gracias a un colorante fluorescente que se une al ADN, se muestra la cromatina. En rojo, gracias a un anticuerpo con fluoróforo que emite en la región del rojo, se muestra la estructura formada por polímeros de una proteína denominada tubulina. En verde, gracias a un anticuerpo con fluoróforo que emite en la región del verde, se muestra la localización de una proteína del poro de la membrana nuclear, la cual envuelve a la cromatina a partir de telofase.Fuente: Daniel Moreno Andrés.
Con la llegada de la GFP y la hueste de proteínas fluorescentes desarrolladas a posteriori, las técnicas de fluorescencia sufrieron una revolución y otorgaron a la microscopia un poder de resolución inimaginable hasta aquel entonces. Por un lado, con la mejora en la especificidad de los anticuerpos y en la variedad y rendimiento de los fluoróforos, las técnicas de inmunofluorescencia iluminaron las estructuras en muestra fijadas (inertes, tal y como explicamos en post anterior). Por otro lado, la cada vez más depurada y poderosa ingeniería genética hacía posible fusionar la secuencia de cualquier proteína de cualquier organismo junto con la secuencia de la GFP (u otra proteína fluorescente). De esta manera, la proteína fusionada a la GFP revelaría su posición dentro la célula al ser iluminada con luz de longitud de onda capaz de encender a la GFP (que es 488nm). Esto trajo varias ventajas pero la mayor de ellas fue que, aunque las proteínas fluorescentes siguen funcionando después de fijar las muestras, también permiten, en muchos casos, observar estructuras microscópicas en células vivas.
En el situiente video se muestra una célula en mitosis. El color rojo se debe a una proteína fluorescente roja denominada mCherry cuya secuencia está fusionada a la secuencia de una histona. Las histonas son proteínas que se unen al ADN en el núcleo celular para empaquetando y protegerlo. El color verde se debe a la GFP, la cual está unida a una proteína que se llama tubulina. La tubulina forma polímeros organizados que actúan como cables que estiran de cada uno de los cromosomas hermanos para distribuirlos igualitariamente entre las dos células hijas. Fuente: Jeremy Jackson-Youtube.
La microscopía de fluorescencia es el vivo ejemplo de cómo el entendimiento profundo del funcionamiento de la materia viva, mezclado con un poco de ingenio e ingeniería, rinde resultados de espectacular belleza a la vez que tremendamente informativos. Mirad si fueron útiles, además de bellos, que fueron clave en los desarrollos que nos llevarían más allá del límite de la resolución óptica para poder observar la vida en toda su magnífica pequeñez.
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